microscopia de fluorescência: princípios do método

Absorção e re-emissão de luz mais fluidos orgânicos e inorgânicos é o resultado de fosforescência ou fluorescência. A diferença entre a fenómenos é a duração do intervalo de tempo entre a absorção e emissão de fluxo luminoso. Quando a fluorescência destes processos ocorrem quase simultaneamente, enquanto fosforescência – com algum atraso.

informações históricas

Em 1852, o cientista britânico Stokes, descrita pela primeira vez fluorescência. Ele introduziu um novo termo, como resultado dos experimentos com fluorita, que emitem luz vermelha sob luz ultravioleta. Stokes notou um fenômeno interessante. Verificou-se que o comprimento de onda da radiação fluorescente é sempre maior do que o fluxo de luz de excitação.

Para confirmar a hipótese, no século 19 houve muitos experimentos. Eles demonstraram que uma variedade de amostras de fluorescência sob a influência de luz ultravioleta. Entre os materiais, entre outras coisas, sido cristais, resinas, minerais, clorofila, fármacos em bruto, compostos inorgânicos, vitaminas, óleos. O uso direto de corantes para testes biológicos só começou em 1930

microscopia de fluorescência: Descrição

Alguns dos materiais utilizados na primeira metade dos estudos do século 20 exibiu especificidade elevada. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Graças ao desempenho, o que não poderia ser alcançado por meio de métodos de contraste, o método de microscopia de fluorescência tornou-se uma ferramenta essencial na investigação biomédica e biológica. Igualmente importantes resultados foram obtidos, e para materiais.

? Que vantagens o método de microscopia de fluorescência? Utilizando novos materiais tornou-se possível e a seleção dos componentes submicroscópicas celulares altamente específico. A microscopia de fluorescência podem detectar moléculas individuais. Uma variedade de corantes permitir a identificação de vários itens de uma só vez. Apesar da resolução espacial limitado do limite de difracção do equipamento, o qual, por sua vez, depende das propriedades específicas da amostra, a identificação de moléculas abaixo deste nível também é bastante possível. Várias amostras após irradiação autofluorescência exposição. Este fenômeno é amplamente utilizado em petrologia, botânica, a indústria de semicondutores.

características

Estudar tecidos animais ou patógenos, muitas vezes complicadas ou muito fracas ou muito fortes autofluorescência inespecífica. No entanto, o valor em estudos adquire introdução, nas componentes de material excitada a um comprimento de onda específico e emitindo a intensidade do fluxo de luz necessária. Fluorocromos agir como corantes capazes de, independentemente, ligados a estruturas (visíveis ou invisíveis). Assim, eles têm uma selectividade elevada para o alvo, e o rendimento quântico.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. microscopia de fluorescência tem sido amplamente utilizado desde o advento de corantes naturais e sintéticos. Eles possuíam certos perfis de intensidade da emissão e de excitação e direcionada para alvos biológicos específicos.

Identificação de moléculas individuais

Muitas vezes, em condições ideais, você pode registrar um elemento de brilho separado. Para isso, entre outras coisas, é necessário fornecer uma suficientemente baixo ruído do detector eo fundo óptico. molécula de fluoresceína ao fracasso devido à fotodegradação pode emitir até 300 mil. Os fótons. A 20% de eficiência de recolha do processo e podem registar-los em uma quantidade de cerca de 60 mil.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. A microscopia de fluorescência com base em fotodiodos de avalanche ou multiplicação electrónica, permitiu aos investigadores para observar o comportamento das moléculas individuais através da segunda, e em alguns casos mesmo minutos.

complexidade

A questão-chave a favor da supressão de ruído de fundo óptico. Devido ao fato de que muitos dos materiais utilizados no projeto de filtros e lentes exibem algum autofluorescência, os esforços dos cientistas nas fases iniciais foram orientados para a produção de componentes com uma fluorescência baixa. No entanto, experimentos posteriores levaram a novas conclusões. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Em particular, verificou-se que a microscopia de fluorescência, baseado em reflexão interna total, permite alcançar um fundo baixo e a luz de excitação de alta intensidade.

mecanismo

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Os princípios da microscopia de fluorescência, com base na reflexão interna total é o uso de onda evanescente ou evanescente. Ela ocorre na fronteira entre meios com diferentes índices de refração. Neste caso, o feixe de luz passa através do prisma. Ele tem um parâmetro alto índice de refração.

O prisma adjacente à solução aquosa ou de vidro com baixo parâmetro. Se um feixe de luz direccionado para ele em um ângulo que é mais crítica, o feixe é totalmente reflectido a partir da interface. Esse fenômeno, por sua vez, faz com que as ondas nonpropagating. Em outras palavras, o campo electromagnético gerado que penetra em uma forma com um parâmetro índice de refracção inferior a uma distância inferior a 200 nanómetros.

A onda evanescente intensidade da luz seria suficiente para excitar fluoróforos. No entanto, por causa de sua extremamente pequena profundidade, seu volume será muito pequeno. O resultado é um fundo de baixo nível.

modificação

microscopia de fluorescência é baseada na reflexão interna total, pode ser implementado com epi-iluminação. Isto requer lentes com elevada abertura numérica (pelo menos 1,4, mas é desejável que ele atingiu 1,45-1,6), e parcialmente iluminado aparelho campo. O último é conseguido com um pequeno tamanho do ponto. Para uma maior uniformidade usando um fino anel, que é bloqueado por uma porção do fluxo. Para o ângulo crítico, após o qual há uma reflexão total, é necessário um nível elevado de refracção do meio de imersão na lente e a tampa de vidro do microscópio.